Wykład 1 histologia - Nowoczesne techniki mikroskopowe by Kłoda(1), 1.Lekarski, I rok, Histologia, Wykłady
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Nowoczesne techniki mikroskopowe
1 mm = 1000µm
1µm = 1000 nm
1 nm = 10 Å
1 Å = 100 pm
Metody utrwalania tkanek
Poprzez usunięcie wody i zastąpienie jej alkoholami (acetonem)
Poprzez związanie grup aminowych białek(formaldehyd, paraformaldehyd, glutaraldehyd)
Zostawiamy wodę, ale blokujemy białka. Białko traci swoją aktywność, np. enzymatyczną
Poprzez stabilizację wody( zablokowanie krystalizacji) w temperaturze > -140
0
C.(witryfikacja)
Histochemia
– wykorzystywanie reakcji chemicznych do badań morfologicznych
Immuno-histochemia
– wykorzystanie substancji z zakresu immunologii ( np. przeciwciała) do
wykazania reakcji barwnej w określonym miejscu – np. na tkance.
Poprzez utrwalanie tkanek dążymy do zatrzymania reakcji chemicznych
Utrwalanie alkoholem/acetonem
Pozytywy
Negatywy
Nie zmienia grup reaktywnych białek
Zmienia strukturę II-II-IV rzędową
( przestrzenną) białek ( denaturacja
białek)
Szybie utrwalanie ( penetracja)
Zbyt długie przetrzymywanie
powoduje stwardnienie materiału
(overfixed)
Utrwaanie małych skrawków (1-4mm)
Krótki czas przechowywania materiału
Utrwalanie aldehydami
Pozytywy
Negatywy
Utrwalanie nieagresywne(12-24
godziny)
Inaktywacja większości enzymów (grup
reaktywnych)
Brak zjawiska nadmiernego
utrwalania(overfixation)
Osłabienie odczynów
immunohistochemicznych
Utrzymanie naturalnej barwy tkanek
Potrzeba płukania tkanek po
utrwaleniu(przed wykonaniem
odczynów)
Możliwość przechowywania tkanek
latami
Utrwalacze Złożone
Utrwalacze makroanatomiczne
– b. dobre do dużych próbek, gorsze odwzorowanie szczegółów
Utrwalacze cytoplazmatyczne
– dobre do małych próbek
Utrwalacze jądrowe
(np. Carnoy’s)
Witryfikacja
Fizyczne utrwalenie tkanki poprzez zestalenie wody bez wytworzenia kryształków. Woda staje się
homogenna i przechodzi w strukturę, przyp. Miód. Jest twarda, zestalona. W Polsce niemożliwe jest
tworzenie wycinków
Rewitryfikacja
– Przywrócenie stanu pierwotnego.
Kriobiologia
Krioprezerwacja tkanek(cryopreservation)
-Zamrażanie(szybkie, wolne, kontrolowane i niekontrolowane)
-Witryfikacja (
to nie zamrażanie!!)
Liofilizacja
Hypotermia(+4 do -33)
Przygotowanie skrawka do witryfikacji:
Wyciąganie wody z komórki poprzez umieszczanie jej w roztworze hiperosmotycznym względem
badanego skrawka.CP – Cryopreservant
Zasady szybkiego zamrażania
Szybkie przejście temp <-90
0
C (optymalna -130
0
C)
Można zastosować spray odbierający z tkanek ciepło(-50
0
C)
Można zastosować płynny CO
2
(-70
0
C). Zmienia się on gwałtownie w gaz i odbiera ciepło z tkanek
Barwienie
Reakcja barwna w oparciu o siły elektrostatyczne
-Proteina-NH
3
+
+ eozyna
-
= Proteina-NH
3
-eozyna
KOLOR CZERWONY
-Proteina-OSO
3
-
+B.metylenowy
+
=Proteina-OSO
3
-
KOLOR NIEBIESKI
-b.metylenowy
Reakcja barwna w oparciu o wiązania kowalencyjne – w reakcjach
histochemicznych
-PAS(periodic acid-Schiff) do wykrywania cukrów
-Wiązanie Abs z FITC
Reakcja barwna w oparciu o siły Van der Waalsa(0,2nm)
Enzymy w histochemii
Enzymy hydrolityczne(
metoda Gomori/Gomori’s acid phosphates)
Enzymy oksydoredukcyjne
Porównanie mikroskopów
Miroskop świetlny –
maksymalne powiększenie 1500x. Światło przechodzi przez próbkę i pada na
soczewkę. Rozdzielczość poniżej 1 nm
Mikroskop elektronowy
– źródłem światła jest katoda. Wiązka elektronów przechodzi przez preparat i
powstaje obraz.
Obraz płaski bez elektronów odbitych!
Mikroskop skaningowy –
Widoczne są wszystkie odbite od preparatu elektrony, które tworzą obraz
przestrzenny.
Mikroskop optyczny,
prześwietleniowy
Prześwietleniowy
mikroskop elektronowy
Oświetlenie
Oświetlenie – Światło
widzialne,
λ = 4000 – 8000 Å
Wiązka elektronów,
λ= 0,04 Å
Maksymalne
powiększenie
2.000 x
5.000.000 x i więcej
Zdolność rozdzielcza
1µm czyli 10.000 Å
1.4 – 2.2 Å
Sposób obserwacji
bezpośredni
Pośredni (obraz tworzony
na ekranie
fluorescencyjnym)
Preparaty
Przeźroczyste optycznie Przeźroczyste dla wiązki
elektronów
Stosowane soczewki
Szklane, kwarcowe
Elektromagnetyczne,
elektrostatyczne
Mikroskop sił atomowych
Uzyskiwany obraz jest przestrzenny. Obraz zbierany jest przez fotodiodę. Mikroskopia badająca
powierzchnię.
Metody badania:
1.Contact mode – laser odpowiednio naciska końcówkę dotykającą preparat. Bada w ten sposób
powierzchnię. Obraz przekształcony jest w impuls elektryczny wyłapywany przez fotodiodę, która
wysyła go do komputera.
2.Tapping mode – końcówa z odpowiednią siłą i określoną częstotliwością dotyka powierzchni
preparatu. Na podstawie zmian częstotliwości tworzy obraz.
Mikroskopia konfokalna
Znalazła zastosowanie w dermatologii i okulistyce. Ogniskuje się na małej powierzchni
W mikroskopie konfokalnym laser jest
źródłem światła(od 400-750 nm). Jest ono
ukierunkowane w stronę preparatu na
określoną płaszczyznę. W momencie
przechodzenia przez preparat wiązka
wyzwala fotony, które wracają po tym
samym torze do detektora. W detektorze
ulegają one wzmocnieniu(wyzwalają
elektrony). Wyzwolony impuls elektryczny
trafia do obróbki końcowej w komputerze.
Wyzwalanie elektronów w fotopowielaczu
przebiega na zasadzie reakcji łańcuchowej.
Wivascope to urządzenie użyteczne w
okulistyce i dermatologii.
Metoda trójbarwna Massona to metoda do
badania tkanki łącznej i zmian
niedokrwiennych. Jest to element
histochemii
[ Pobierz całość w formacie PDF ]