Wykład 4 - Produkcja białek rekombinacyjnych, Biochemia, Biochemia, Biotechnologia farmaceutyczna
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Wykład 4: PRODUKCJA BIAŁEK REKOMBINACYJNYCH.
Podstawowe wła
ś
ciwo
ś
ci systemy otrzymywania białek rekombinacyjnych w
układach heterologicznych.
Otrzymywanie matrycy koduj
Ą
cej białko b
Ę
d
Ą
ce przedmiotem zainteresowania (np. lek
biopodobny lub białko dotychczas niebadane)
Podstawowym etapem jest skonstruowanie dwuniciowej sekwencji DNA koduj
ą
cej badane białko.
·
Białko, którego syntez
ę
przewiduje si
ę
w układzie heterologicznym mo
ż
e oryginalnie by
ć
kodowane prze gen bezintronowy lub gen zawieraj
ą
cy liczne introny.
·
Funkcjonalne białko mo
ż
e wymaga
ć
potranslacyjnych modyfikacji.
·
Funkcjonalne białko mo
ż
e by
ć
fragmentem lub fragmentami bardziej zło
ż
onego pierwotnego
białka, z którego po translacji usuwane s
ą
niektóre sekwencje aminokwasowe.
·
Funkcjonalne białko mo
ż
e składa
ć
si
ę
z kilku podjednostek kodowanych przez ró
ż
ne geny.
Je
ś
li to mo
ż
liwe, najprostszym sposobem skonstruowania sekwencji koduj
ą
cej białko jest posłu
ż
enie
si
ę
metod
ą
PCR (je
ś
li gen jest genomem bezintronowym) lub metod
ą
RT-PCR (je
ś
li gen j introny).
1
Wektor:
Wektor, do którego wklonowana b
ę ą ęą
zainteresowania powinien przede wszystkim:
ektor, do którego wklonowana b
ę
dzie sekwencja koduj
ą
ca białko b
ęą
zainteresowania powinien przede wszystkim:
ę ą
ca białko b
ę
d
ą
ce przedmiotem
·
Zawiera
ć
miejsce wielokrotnego klonowania (ang.
miejsc restrykcyjnych ułatwiaj
ą ę
miejsce wielokrotnego klonowania (ang.
multicloning site
, MCS) ze znaczn
ą ą
miejsc restrykcyjnych ułatwiaj
ą
cych insercj
ę
egzogennego DNA;
promotorowy poprzedzaj
ą
cy MCS. Promotor powinien funkcjonowa
ć
komórkach, w których b
ę
dzie produkowane rekombinacyjne białko.
innych elementów zapewniaj
ą
cych prawidłowy przebieg transkrypcji i translacji
, MCS) ze znaczn
ą
liczb
ą
·
Region promotorowy poprzedzaj
ą ć
komórkach, w których b
ę
ą
cy MCS. Promotor powinien funkcjonowa
ć
wydajnie w
·
Szereg innych elementów
transgenu;
ą
cych prawidłowy przebieg transkrypcji i translacji
·
Elementy ułatwiaj
ą
ce oczyszczanie produkowanego białka;
ą
ce oczyszczanie produkowanego białka;
ą
ce prowadzenie prac analitycznych
ą
ce markery selekcyjne
·
Elementy ułatwiaj
ą
ce prowadzenie prac analitycznych
·
Elementy koduj
ą
ce markery selekcyjne
Organizmy, w którym produkowane mog
ą
Organizmy, w którym produkowane mog
ą
by
ć
rekombinowane białka:
ć
rekombinowane białka:
Podstawowym gospodarzem, który wykorzystywany jest do produkowania białek rekombinowanych
w wła
ś
ciwo
ś
ciach terapeutycznych s
ą
Podstawowym gospodarzem, który wykorzystywany jest do produkowania białek rekombinowanych
ś ś
ciach terapeutycznych s
ą
bakterie, przede wszystkich
Escherichia coli
Podstawowym gospodarzem, który wykorzystywany jest do produkowania białek rekombinowanych
Escherichia coli
.
Istniej
ą
dziesi
ą
tki szczepów
E.coli
najbardziej przydatny do realizacji zało
ż
E.coli
zmodyfikowanych genetycznie tak, aby mo
ż ć
najbardziej przydatny do realizacji zało
ż
onego celu.
zmodyfikowanych genetycznie tak, aby mo
ż
na było wybra
ć
W bakteriach mog
ą
by
ć
otrzymywane
w znacz
ą
cym stopniu od potranslacyjnych modyfikac
eukariotycznych.
ąć
otrzymywane jedynie takie białka, których aktywno
ść
biologiczna nie zale
ż
ą
cym stopniu od potranslacyjnych modyfikacji, które mog
ą
jedynie zaj
ść
ść
biologiczna nie zale
ż
y
ą
jedynie zaj
ść
w komórkach
Inne organizmy:
Dro
ż
d
ż
e:
Saccaromyces cerevisiae
Komórki insektów: system bakulowirusowy
Komórki ssacze: np. linia CHO (
Saccaromyces cerevisiae
i
Pichia pastoris
Komórki insektów: system bakulowirusowy
Komórki ssacze: np. linia CHO (
chinese hajster ovary cells
).
Uproszczony schemat poszukiwania
poszukiwania wła
Ś
ciwej linii komórkowej do produkcji biofarmaceutyku.
i komórkowej do produkcji biofarmaceutyku.
2
Podstawowe wła
ś
ciwo
ś
ci transgenu:
Egzogenny gen mo
ż
e znajdowa
ć
si
ę
w cytoplazmie, lub mo
ż
e by
ć
wł
ą
czony w chromosom bateryjny.
Poniewa
ż
układy transkrypcyjne i translacyjne s
ą
ró
ż
ne u eukariontów i u bakterii, zatem aby
egzogenny gen mógł ulec w bakteriach transkrypcji i translacji konstrukt zawieraj
ą
cy eukariotyczny
gen powinien zawieraj
ą
cy eukariotyczny gen powinien spełnia
ć
odpowiednie wymagania:
gen powinien by
ć
pod kontrol
ą
wła
ś
ciwego promotora
konstrukt powinien zawiera
ć
sekwencje umo
ż
liwiaj
ą
ce rozpoznanie kodowanego przeze
ń
tran
skryptu przez rybosom bakteryjny.
Szereg firm oferuje rozmaite promotory. Istniej
ą
biblioteki promotorów, co pozwala na wybór
najbardziej wła
ś
ciwego do okre
ś
lonych zastosowa
ń
.
Przykładami najcz
ęś
ciej wykorzystywanych promotorów s
ą
:
Promotor laktozowy (
lac
). głównie wariant
lacUV5.
Promotor
trp-lac
tzw.
tac
(tac pomoter)
Promotor
λ
P
L bakteriofaga lambda
Promotor T7 (z bakteriofaga T7)
Schemat konstruktu koduj
ą
cego
rekombinowane białko:
MCS
– miejsce wielokrotnego klonowania.
Promotor
– region zawieraj
ą
cy miejsce wi
ą
zania
bakteryjnej polimerazy RNA sekwencje reguluj
ą
ce
transkrypcj
ę
.
Terminacja transkrypcji
– region zawieraj
ą
cy
wszystkie sekwencje regulatorowe konieczne do
zako
ń
czenia
transkrypcji
przez
polimeraz
ę
bakteryjn
ą
.
RBS
– sekwencja umo
ż
liwiaj
ą
ca rozpoznanie mRNA przez bakteryjny rybosom.
Znaczniki N- i C-ko
Ń
cowe
. Sekwencje koduj
ą
ce odpowiednie białka lub peptydy, które zwi
ą
zane z
biosyntetyzowanym białkiem umo
ż
liwiaj
ą
jego oczyszczenie lub zwi
ę
ksz
ą
jego rozpuszczalno
ść
.
Miejsce endoproteolizy
– sekwencje koduj
ą
ce miejsca rozpoznawane przez swoiste proteazy, które
mo
ż
na wykorzysta
ć
w celu odci
ę
cia znaczników.
Marker selekcyjny
– gen koduj
ą
cy białko nadaj
ą
ce cech
ę
oporno
ś
ci na antybiotyki. Po transformacji
komórek jedynie te komórki bakterii, w których znajduje si
ę
transformowany wektor b
ę
d
ą
oporne na
okre
ś
lony antybiotyk.
3
Podstawowe sekwencje regulatorowe promotorów
Podstawowe sekwencje regulatorowe promotorów bakteryjnych
Najwa
ż
niejszymi sekwencjami regulatorowe w obszarze promotora ustala si
ę
w tym poprzez porównanie struktury wielu promotorów i wyznaczenie, jakie układy sekwencji
wyst
ę
puj
ą
najcz
ęś
ciej.
ż
niejszymi sekwencjami regulatorowe w obszarze promotora ustala si
ę
rozmaitymi metodami,
w tym poprzez porównanie struktury wielu promotorów i wyznaczenie, jakie układy sekwencji
ę
rozmaitymi metodami,
w tym poprzez porównanie struktury wielu promotorów i wyznaczenie, jakie układy sekwencji
Bloku sekwencji wyst
ę
puj
ą
ce najcz
ęś ą ę
sekwencjami zgodno
Ś
ci.
ęą
ce najcz
ęś
ciej i maj
ą
ce istotne znaczenie funkcjonalne nazywa si
ę
ęą ęś ą
ce istotne znaczenie funkcjonalne nazywa si
ę
Dla promotorów bakteryjnych sekwencj
ą ś
Dla promotorów bakteryjnych sekwencj
ą
zgodno
ś
ci jest:
TTGACA----17±1----TATAAT
TATAAT
Sekwencja
TTGACA
nazywana jest
zasad
ę
T
znajduje si
ę
najcz
ęś
ciej w odległo
ś
nazywana jest
sekwencj
Ą
(-35),
poniewa
ż
jej „
ś
rodek” wyznaczony przez
ę ęś
ciej w odległo
ś
ci (-35) od miejsca inicjacji transkrypcji (+1).
ś
rodek” wyznaczony przez
35) od miejsca inicjacji transkrypcji (+1).
Sekwencja
TATAAT
nazywana jest sekwencj
ą
zasad
ę
T
znajduje si
ę
najcz
ęś
ciej w odległo
ś
nazywana jest sekwencj
ą
(-10), poniewa
ż
jej „
ś
rodek” wyznaczony przez
ę ęś
ciej w odległo
ś
ci (-10) od miejsca inicjacji transkrypcji (+1).
ż ś
rodek” wyznaczony przez
0) od miejsca inicjacji transkrypcji (+1).
Cz
ę
sto
ść
wyst
ę
powania okre
ś
lonej zasady w okr
ę
ęść ę ś
lonej zasady w okr
ę
slonej pozycji:
T
(69)
T
(79)
G
(61)
A
(56)
C
(54)
A
(54)
(54)-
16
(17)
17
(43)
18
(17)-
T
(77)
A
(76)
T
(…)
A
(61)
A
A
(56)
4
Sekwencje regulatorowe promotorowy słabych i silnych:
Sekwencje regulatorowe promotorowy słabych i silnych:
Przykład silnego promotora (
promotor recA)
promotor recA)
TTGATA – 16 – TATAAT
TTGACA –17 – TATAAT
(sekwencja zgodno
ś
(sekwencja zgodno
ś
ci)
Przykład słabego promotora (
promotor
promotor araBAD)
CTGACG – 18 – TACTGT
TTGACA –17 – TATAAT
(sekwencja zgodno
ś
(sekwencja zgodno
ś
ci)
Przykład
: promotor
lacUV5
promoter jest silniejszy (lepsz
promoter jest silniejszy (lepszy) ni
ż
promotor
lac
.
Promotor lacUV5
TTTACA –
Promotor lac
– 18 – TATAAT
–18 – TATGTT
– 17 – TATAAT
(sekwencja zgodno
ś
ci)
Promotor
lacUV5
jest zmutowan
ą ą
cech regulatorowych promotora
wykorzystanie promotora
lacUV5
jest zmutowan
ą
wersj
ą
promotora
lac
. Poniewa
ż
promotor
lacUV5
cech regulatorowych promotora
lac
, a przy tym jest znacznie silniejszy, st
ą ę
lacUV5
w konstruowaniu wektorów ekspresyjnych.
lacUV5
zachowuje wiele
, a przy tym jest znacznie silniejszy, st
ą
d wynika cz
ę
ste
5
TTTACA –
TTGACA –
[ Pobierz całość w formacie PDF ]